Détermination de l’indice hémolytique

Détermination de l’indice hémolytique

 (d’apèrs Borkowski et Krzysztofikowa (1959)Triterpenoïdes en physiologie végétale et animale vg.)

 

L’indice hémolytique est le nombre de millilitres d’une suspension à 2 % d’érythrocytes subissant l’hémolyse totale sous l’influence d’un extrait d’un gramme de saponine standard dans des conditions d’essai bien déterminées

Mode opératoire

On verse la partie d’une solution 3.65 % stérilisé de citrate de sodium dans une bouteille en verre foncé au bouchon rodé et l’on mouille soigneusement les parois.

Ensuite on y fait 9 parties de sang de bœuf directement de l’artère d’un jeune animal mâle de l’abattage, et ayant fermé la bouteille. On mélange le contenu soigneusement en la retournant plusieurs fois.

Afin de préparer une suspension à 2 % d’érythrocytes on agite le liquide dans la bouteille et on en prélève 1 ml avec une micro pipette.

On transfère cette quantité dans un flacon de 50 ml que l’on remplit jusqu’au trait de repère avec une solution isotonique tamponnée de chlorure de sodium.  Le mélange de sang et de citrate peut être conservé au frigidaire pendant 8 jours au plus.

Il faut préparer une nouvelle suspension d’érythrocytes immédiatement avant chaque essai ; une telle suspension ne pourra être utilisée que pendant 24 heures.

Solution isotonique tamponnée de chlorure de sodium :

  • Phosphate de sodium secondaire hydraté         3.95 g
  • Phosphate de potassium primaire                      0.76 g
  • Chlorure de sodium                                    7.20 g
  • Eau distillée                                      qsp     1000 ml
    • Cette solution est conservée dans un flacon jaugé de 1 l et peut être conservée pendant un mois.

Solution saponine standard

  • On pèse exactement 0.02 de saponine standard Wh = 15 000 que l’on dissout ensuite dans un flacon de 100 ml dans la solution isotonique tamponnée de chlorure de sodium. Cette solution est conservée à l’abri de la lumière et sera conservée pendant un mois.

 

Détermination préliminaire

Dans trois ou quatre éprouvettes on prépare une série de dilutions dont chacune est de 50 % de la précédente. Dans chacune des éprouvettes n° 2.3 et 4 on introduit 1 ml de la solution isotonique tamponnée de chlorure de sodium. Dans chacune des éprouvettes n° 1 et 2 on transfère 1 ml de l’extrait de la matière première, préparé dans des conditions standard pour chaque espèce médicinale. On mélange plusieurs fois le contenu de l’éprouvette n°2 en aspirant le liquide dans une pipette et en le laissant s’écouler , après quoi l’on prélève 1 ml du liquide que l’on transfère dans l’éprouvette suivante, et ainsi de suite. Le millilitre de liquide prélevé dans la dernière éprouvette est rejetée. Ensuite on ajoute au contenu de chaque éprouvette 1 ml de la suspension d’érythrocytes qui a été agité soigneusement au préalable, et l’on mélange avec précaution en empployant un mouvement rotatoire et en éviant la formation d’écume. Après 6 heures on procède à la lecture des résultats en déterminant l’éprouvette  dans laquelle l’hémolyse a été totale, cad, celle où le liquide est translucide et rouge, ne présentant pas de précipité d’érythrocytes  sur le fond. Un tel précipité se signalerait en formant un petit nuage lorsque l’éprouvette est remuée un peu fortement.

Il faut à peu près 6 heures pour préparer les extraits alcooliques et pour les réduire en résidu sec. Le résidu sec fraîchement dissous suivant la prescription sert à la détermination préliminaire et à la détermination principale. En se basant sur l’éprouvette présentant l’hémolyse totale de l’extrait de matière première au volume double (si ce fut le cas de l’éprouvette n° 2 ou quadruple (en admettant que l’hémolyse totale ait eu lieu dans l’éprouvette n°3 ou octuple dans le cas de l’éprouvette n°4 et l’on procède à l’essai principal.

Détermination  prinicipale

Ayant préparé  une série d’éprouvettes numérotées, on introduit 1 ml de la solution isotonique tamponnée de chlorure de sodium dans chacun des numéros de 2 à 6. Dans le n° 2 5 ml de l’extrait, que l’on mélange ensuite en aspirant le liquide plusieurs fois avec une pipette et en le laissant écouler, après quoi l’on transfère 5 ml du liquide dans l’éprouvette n°3 où l’on agite de la même manière, et ainsi de suite. Après avoir mélangé le contenu de l’éprouvette n° 6, les 5 ml dans le tube n°2 pour le reste, on agit comme dans la première série.

Dans chacune des éprouvettes des deux séries, on introduit 1 ml de la suspension d’érythrocytes , après l’avoir agitée. Au bout de 15 minutes, on mélange soigneusement le contenu de chaque éprouvette, tout en évitant de donner lieu à la formation d’écume ; on mélange encore deux fois, au bout de 17 à 20 heures. Procède à la lecture des résultats après 24 heures à partir de la préparation des deux séries.

En établissant le résultat, on se base sur l’éprouvette contenant la plus basse concentration du produit actif et présentant encore une hémolyse totale des érythrocytes

On trouve la concentration du liquide dans cette éprouvette d’après le tablea suivant (exprimé en mg de matière première ou de saponine standard par 1 ml), et l’on calcule l’indice hémolytique d’après la formule Wh = S x a/b où S = la valeur hémolytique de la saponine standard = 15 000, a  désigne le nombre de mg de saponine standard qui suffisent encore à provoquer l’hémolyse totale, et b le nombre de mg de matière première produisant cet effet.

Les essais doivent être faits à une température d’environ 20°C.

 

Tableau pour déterminer la concentration dans les éprouvettes

 

Matiérespremiéres

Rad. Senegae

Rad. Primulae

Rad. Saponariae

Herba Herniariae

Concentration dans l'éprouvette en mg/ml

I

II

III

IV

V

VI

Numéro de l'éprouvette

 

 

 

I

4,0

4,0

3,33

2,78

2,31

1,93

1,61

 

 

I

II

2,0

2,0

1,67

1,39

1,16

0,96

0,80

I

I

II

III

1,0

1,0

0,83

0,69

0,58

0,48

0,40

II

II

III

IV

0,5

0,5

0,42

0,35

0,29

0,24

0,20

III

III

IV

 

0,25

0,25

0,21

0,17

0,14

0,12

0,10

Saponine Standard………………………………………………………………………….

0,20

0,166

0,138

0,115

0,096

0,080